Réaction en chaîne par polymérase | Un outil important en biotechnologie moléculaire

PCR - acronyme de réaction en chaîne de polymérase avec marqueur, arrière-plan du concept
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Réaction en chaîne par polymérase | Un outil important en biotechnologie moléculaire

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Qu'est-ce que la réaction en chaîne par polymérase?

la réaction en chaîne de la polymérase (PCR) est un autre biologie moléculaire technique de production enzymatique d'ADN sans utiliser de machinerie cellulaire, par exemple, levure ou E. coli. La méthode permet une quantité limitée de L'ADN être amplifiée plusieurs plis de façon spectaculaire. PCR est régulièrement utilisé dans clinique, légalet des laboratoires biologiques à des fins diverses, telles que la détermination empreintes génétiques, diagnostic de maladie, clonage de gènes, et  test de paternité

Cette technique a été créée en 1983 par Kary Mullis. La PCR est actuellement une procédure cruciale et importante utilisée en biologie appliquée. Ceux-ci incorporent Clonage d'ADN pour le séquençage, la phylogénie basée sur l'ADN ou la recherche active de l'expression génique et la détermination des maladies génétiquement transmises. En 1993, Mullis a reçu le prix Nobel de chimie pour ses travaux sur la PCR. 

La PCR est généralement réalisée dans un mélange réactionnel d'un volume total de 0.1 à 0.2 ml dans des tubes de réaction (volumes de 0.2 à 0.5 ml) dans un instrument appelé un thermocycleur. Un cycleur thermique chauffe et refroidit l'ADN pour atteindre les températures requises à chaque étape de la réaction. Les tubes de réaction à paroi mince fournissent la conductivité thermique souhaitée permettant un équilibrage thermique plus rapide. Habituellement, les thermocycleurs ont des dessus ou des couvercles chauffés qui empêchent la condensation des composants de réaction au sommet du tube. 

Polymerase Chain Reaction
Figure: Thermocycleur
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Exigences de la réaction en chaîne par polymérase

  • L'ADN fragment à amplifier (ADN matrice ou ADNc)
  • amorces (amorce directe et amorce inverse) capable de reconnaître les extrémités de l'ADN matrice. Les amorces ont généralement une longueur de 18 à 25 paires de bases.
  • ADN polymérase thermostable (Polymérase Taq) catalyse la synthèse de l'ADN. La Taq polymérase est obtenue à partir de Thermus aquaticus.
  • nucléotides
  • Amortissement (fournit un milieu optimal pour l'activité de l'ADN polymérase thermostable)
Figure: l'ADN est amplifié par PCR
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Principe de fonctionnement de la réaction en chaîne par polymérase

La PCR est appelée réaction en chaîne parce que les brins nouvellement synthétisés serviront de matrice pour la synthèse ultérieure de l'ADN dans les cycles suivants. 

La PCR se compose de 3 réactions successives:

  • Dénaturation de l'ADN: Le processus de dénaturation sépare les brins d'ADN double brin. Pour l'ADN humain, la température de dénaturation est d'environ 93-95oC. La dénaturation de l'ADN se fait en rompant les liaisons hydrogène entre les deux brins polynucléotidiques de l'ADN. Le processus de dénaturation est souvent effectué pendant 5 minutes ou une durée prolongée pour garantir que les deux brins de l'ADN matrice sont complètement séparés l'un de l'autre. Le processus de dénaturation active également l'ADN polymérase thermostable.
  • Recuit d'apprêt: Après dénaturation, des amorces sens et inverse sont introduites dans le mélange réactionnel. La solution est ensuite refroidie pour le recuit de l'amorce. Habituellement, le recuit de l'amorce se produit entre 50 et 70oC en fonction de la Tm (température de fusion) de l'ADN. Idéalement, la température de recuit est de 5oC sous le Tm. La température d'hybridation doit être basse pour former un hybride entre l'amorce et l'ADN matrice et suffisamment élevée pour empêcher les hybrides mal appariés. La Tm de l'ADN dépend uniquement de la teneur en GC et AT de l'ADN. L'étape de recuit de l'amorce prend généralement 1 à 2 minutes. Tm peut être déterminée expérimentalement ou calculée théoriquement par la formule mentionnée ci-dessous:

Tm = [4 x (G + C)] + [2 x (A + T)]oC

  • Synthèse d'ADN: L'ADN polymérase thermostable (Taq polymérase) se lie à proximité de la région de liaison de l'ARN et incorpore les nucléotides libres pour allonger et synthétiser un nouveau brin d'ADN adjacent au brin matrice. La température optimale de l'étape d'extension dépend du type de polymérase utilisée; pour la Taq polymérase, la température optimale est d'environ 72oC. La durée de cette étape d'extension dépend de la longueur de l'ADN matrice et de l'efficacité de l'ADN polymérase thermostable; généralement, c'est une paire de kilobases par minute.

Toutes les réactions mentionnées ci-dessus sont répétées 30 fois pour obtenir environ 1 milliard de copies de l'ADN matrice.

Figure: Représentation schématique de l'amplification de l'ADN par réaction en chaîne par polymérase
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Étapes de la réaction en chaîne de la polymérase

Le processus de PCR est divisé en trois étapes:

  • Amplification exponentielle: L'ADN polymérase remplit la fonction optimale et à la fin de chaque cycle, la quantité de produit est doublée. Seule une petite quantité d'ADN doit être présente au point de départ de la réaction car la réaction est très sensible.
  • Étape de nivellement: L'ADN polymérase présente une activité moindre en raison de la moindre disponibilité des réactifs tels que les nucléotides.
  • Plateau: il ne se forme plus de produit en raison de l'épuisement du réactif.

Utilisations de la réaction en chaîne par polymérase

La PCR peut être utilisée pour identifier de nombreuses anomalies liées au génome, un large éventail d'analyses et d'expérimentations. Quelques exemples d'utilisation de la PCR sont présentés ci-dessous:

  • Identification d'agents infectieux comme le CMV, les mycoplasmes, la pneumonie, les maladies contagieuses et liées aux protozoaires, l'hépatite, etc. dans l'échantillon.
  • Détermination de la malignité, en particulier dans le cas du lymphome et de la leucémie. 
  • Test de paternité et empreinte génétique. 

La PCR permet une identification précoce des anomalies qui sont actuellement les plus développées dans la recherche contre le cancer. Les mesures PCR peuvent être effectuées directement sur les échantillons d'ADN génomique pour reconnaître les cellules malignes spécifiques de la translocation avec une sensibilité de plus de 10,000 XNUMX fois par rapport à toute autre méthode. 

La PCR identifie également les micro-organismes non cultivables et à croissance lente, tels que les mycobactéries, les micro-organismes anaérobies et les virus, à partir de techniques de culture tissulaire et de modèles animaux. Les applications démonstratives de la PCR en microbiologie sont la reconnaissance d'agents pathogènes et la capacité de différencier les souches non pathogènes des souches pathogènes en identifiant les gènes spécifiques. 

La PCR est utilisée pour intensifier un petit morceau d'un brin d'ADN. Ce brin d'ADN peut être un gène complet ou simplement une partie d'un gène. Contrairement aux systèmes vivants, le cycle de PCR ne peut amplifier que de courts fragments d'ADN jusqu'à 10 paires de kilobases. Diverses autres techniques peuvent amplifier des fragments d'ADN jusqu'à 40 kb, ce qui est toujours inférieur à la taille de l'ADN chromosomique d'une cellule eucaryote - par exemple, une cellule humaine contient environ trois milliards de paires de bases de nucléotides. 

Test paternel peut être réalisée à l'aide de la PCR en prenant l'ADN des individus en conflit. L'ADN des individus testés est amplifié et digéré par des enzymes de restriction et analysé par électrophorèse sur gel. Le motif des fragments d'ADN sur le gel agrose est connu sous le nom d'empreinte ADN de l'individu. Les personnes proches ou liées au sang auront un empreinte génétique modèle comparé aux individus éloignés ou non apparentés. Les empreintes digitales obtenues peuvent être analysées plus avant pour le parent-enfant ou les frères et sœurs avec deux ou plusieurs empreintes génétiques (ADN). Les empreintes ADN obtenues peuvent être utilisées pour connaître les relations évolutives entre les organismes. 

Sa taille permet de reconnaître facilement le produit final de la PCR sur électrophorèse sur gel d'agarose. L'électrophorèse sur gel d'agarose est réalisée en injectant les échantillons d'ADN dans le gel d'agarose. Le courant électrique est passé à travers le gel d'agarose pour connaître la mobilité des échantillons d'ADN. Les fragments d'ADN plus petits se déplacent plus rapidement dans le gel et vice-versa. Le produit PCR et le fragment d'ADN échantillon sont identifiés en introduisant une échelle d'ADN dans le gel d'agarose. L'échelle d'ADN contient des molécules d'ADN de taille connue. 

Auparavant, l'identification de la maladie génétique par l'observation du génome était une tâche difficile. Plus tard, par le développement de la PCR, ce processus est raccourci. Tout gène d'intérêt peut être facilement amplifié en utilisant des amorces appropriées, puis séquencé pour détecter des mutations dans l'ADN. L'identification précoce de certaines infections virales mortelles peut également être effectuée par PCR. 

Figure: La prise d'empreintes ADN est utilisée pour les tests paternels
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Types de réaction en chaîne par polymérase

Sur la base de quelques modifications appropriées de la technique, la réaction en chaîne de la polymérase est classé dans les types suivants:

  • PCR imbriquée
  • PCR inverse
  • Transcription inverse (RT-PCR)
  • PCR asymétrique
  • Quantitatif (PCR-Q-PCR)
  • PCR quantitative en temps réel (QRT-PCR)
  • PCR Touchdown
  • PCR de colonie
  • PCR spécifique à l'allèle
  • Assembly PCR ou Polymerase Cycling Assembly (PCA)
  • PCR asymétrique
  • Linéaire après la PCR exponentielle (LATE-PCR)
  • PCR commutée
  • Amplification dépendante de l'hélicase
  • PCR à démarrage à chaud
  • PCR spécifique inter-séquence
  • PCR inverse
  • PCR médiée par ligature
  • PCR spécifique à la méthylation
  • PCR mini-amorce

Avantages de la réaction en chaîne par polymérase

  • La réaction en chaîne par polymérase peut être utilisée pour l'identification d'une variété d'anomalies génétiques.
  • La PCR est utilisée dans un large éventail d'expériences et de procédures de laboratoire en biologie moléculaire.
  • La PCR peut détecter des tumeurs malignes telles que la leucémie, le lymphome, etc., et diverses autres conditions telles que Toxoplasma gondi, bactériémie staphylococcique, infections paludéennes, etc.
  • La prise d'empreintes génétiques et les tests de paternité impliquent la PCR comme étape cruciale.
  • La sensibilité et la spécificité élevées de la PCR en font un outil important pour les expériences basées sur la biotechnologie et la biologie moléculaire.

Inconvénients de la réaction en chaîne par polymérase

  • La réaction en chaîne par polymérase nécessite un cycleur thermique, un assemblage électrophorétique d'ADN, un kit d'isolation d'ADN et d'autres produits chimiques coûteux, ce qui rend le processus coûteux.
  • Nécessite des techniciens formés, qualifiés et expérimentés pour mener des expériences.
  • Des laboratoires de niveau de sécurité de base avec déshumidificateurs et installations à flux laminaire sont nécessaires.
  • Il est difficile de se permettre des tests basés sur la PCR pour le public ordinaire.
  • Toutes les maladies n'ont pas pu être identifiées et diagnostiquées par PCR.
  • Possibilité d'obtenir des résultats faux positifs et faux négatifs.

Conclusions:

La réaction en chaîne par polymérase est une technique couramment utilisée et largement acceptée pour l'identification de plusieurs agents infectieux mortels avec sensibilité et spécificité. La PCR est utilisée dans divers centres médicaux avancés, laboratoires modernes et instituts médicaux en tant que module de diagnostic et de recherche de routine. La réaction en chaîne de la polymérase joue un rôle crucial dans l'identification des anomalies représentant des symptômes cliniques atypiques; La PCR permet une détection précoce de ces types de déficiences. La détection précoce peut aider à mieux gérer l'individu, ce qui peut réduire le fardeau social et économique de la famille du sujet.

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Vérificateur de concepts QCM

Question n° 1: Un étudiant effectue une PCR pour amplifier un échantillon d'ADN matrice. Mais, il a oublié d'ajouter l'amorce d'ADN dans l'expérience. Laquelle des options suivantes représente le meilleur résultat possible?

A- La réaction n'aura pas lieu.

B- La réaction fonctionnera, mais le processus amplifiera des régions non spécifiques (pas la partie ADN souhaitée de l'ADN.

C- La réaction fonctionnera mais à un rythme prolongé

D- La réaction fonctionnera et le produit présentera des mutations indésirables.

Option A: «La réaction n'aura pas lieu» est la bonne réponse.

Explication: Les amorces sont essentielles au fonctionnement de la PCR. La Taq polymérase en a besoin pour la liaison (dans l'étape d'hybridation) pour initier la réplication de l'ADN. Ainsi, la PCR ne fonctionnera pas en l'absence d'amorces et aucune amplification n'aura lieu.

Question n° 2: Un étudiant / chercheur souhaite insérer le gène de l'hémoglobine humaine dans un vecteur d'expression pour cloner et exprimer le gène dans des cellules de souris afin d'analyser le phénotype résultant. Laquelle des séquences de procédures suivantes permettra à l'étudiant / chercheur de cloner le gène avec succès?

Option A:

1. Amplifier le gène par PCR

2. Utilisez une enzyme de restriction pour couper le vecteur d'expression

3. Gène ligaturé et vecteur digéré

Option B: 

1. Gène ligate

2. Utilisez une enzyme de restriction pour couper le vecteur d'expression 

3. Amplifier le gène et le vecteur d'expression digéré par PCR

Option C:

1. Utilisez une enzyme de restriction pour couper le vecteur d'expression

2. Amplifier le gène par PCR

3. Gène ligaturé et vecteur digéré

Option D :

1. Utilisez une enzyme de restriction pour couper le vecteur d'expression

2. Gène ligaturé et vecteur digéré

3. Amplifier le gène via PCR

Option A: Est le correct option 

1. Amplifier le gène par PCR

2. Utilisez une enzyme de restriction pour couper le vecteur d'expression

3. Gène ligaturé et vecteur digéré

Explication: Premièrement, nous utiliserons la PCR pour amplifier le gène d'intérêt du génome humain ayant des sites de restriction aux extrémités (cela aidera à sa ligature à un vecteur digéré par une enzyme de restriction). Plus tard, le vecteur d'expression doit être digéré en utilisant la même enzyme de restriction, puis le vecteur digéré et le gène amplifié ont été ligaturés ensemble. Le produit final sera composé de deux segments: le vecteur d'origine et le gène d'intérêt.

Question n° 3: Quel instrument est utilisé pour compléter l'amplification de l'ADN par PCR?

A- Analyseur génétique

B- spectrophotomètre UV

C- Thermocycleur

D- Centrifugeuse

Option C: Thermocycler est la bonne réponse

Explication: Le thermocycleur peut être réglé pour exécuter un cycle des étapes de dénaturation, de recuit et d'extension, respectivement, dans une petite quantité du volume de réaction. Un cycleur thermique est utilisé pour effectuer une amplification par PCR.

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À propos du Dr Abdullah Arsalan

Je suis Abdullah Arsalan, j'ai terminé mon doctorat en biotechnologie. J'ai 7 ans d'expérience en recherche. J'ai publié jusqu'à présent 6 articles dans des revues de renommée internationale avec un facteur d'impact moyen de 4.5 et peu d'autres sont pris en compte. J'ai présenté des articles de recherche dans diverses conférences nationales et internationales. Mon domaine d'intérêt est la biotechnologie et la biochimie avec un accent particulier sur la chimie des protéines, l'enzymologie, l'immunologie, les techniques biophysiques et la biologie moléculaire.

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