Microscopie à fluorescence : 5 faits importants à connaître

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Qu'est-ce que la microscopie à fluorescence?

Microscopes à fluorescence un type de microscope composé qui fonctionne avec plusieurs variantes de sources lumineuses ayant différentes gammes de longueurs d'onde pour la fluorescence d'un spécimen afin de produire des images remplaçant l'utilisation de la transmission, de l'absorption, de la réflexion et de la diffusion. Ces variantes microscopiques sont principalement utilisées pour l'observation d'échantillons biologiques. La microscopie à fluorescence peut être réalisée en utilisant la conception simple d'un microscope à épi-fluorescence ou d'un microscope con-focal complexe.

Comment fonctionne la microscopie à fluorescence?

L'échantillon est d'abord conservé sur la platine microscopique. L'échantillon est ensuite éclairé en fonction de la quantité de lumière nécessaire. En microscopie à fluorescence, la lumière de différentes longueurs d'onde est utilisée pour éclairer l'échantillon et cette lumière est ensuite absorbée par le fluorophores présent dans l'échantillon qui émet en outre un faisceau lumineux de longueurs d'onde plus longues ou d'une couleur différente de celle de la lumière entrante. Un filtre d'émission spectrale est utilisé pour séparer la lumière émise la plus faible de la lumière d'éclairage plus forte. Un microscope à fluorescence général comprend les parties suivantes.

1. Un filtre d'excitation.
2. Un miroir dichroïque ou un séparateur de faisceau.
3. Un filtre d'émission.
4. Une source de lumière (qui peut être une lampe à arc au xénon, une lampe à vapeur de mercure, des LED haute puissance ou des lasers).
5. Un ensemble de lentilles d'objectif.
6. Une lentille oculaire.
7. Une scène pour tenir l'échantillon.
8. Un détecteur.

Le séparateur de faisceau dichroïque et les filtres d'excitation et d'émission sont choisis comme tels que l'excitation spectrale soit compatible avec les caractéristiques d'émission, du fluorophore utilisé pour le marquage des échantillons et c'est ainsi que la distribution d'une seule couleur ou fluorophore est détectée à ce moment . Pour observer des images multicolores, plusieurs images monochromes doivent être combinées. Certaines conceptions microscopiques sont livrées avec un CCD (dispositif à couplage de charge) dans le tube du microscope à la place d'une lentille oculaire. Dans un microscope CCD installé, la formation d'image se produit sur un écran de contrôle en plaçant le CCD sur le plan d'image intermédiaire.

Qu'est-ce que la microscopie à épifluorescence?

En microscopie Epi-fluorescence, l'excitation de l'échantillon avec fluorescence et la détection de la lumière fluorescente émise se fait en suivant le même chemin de lumière, c'est-à-dire à travers la lentille de l'objectif. Ces microscopes sont spécialement utilisés pour l'observation d'échantillons vivants. Pour obtenir une plus grande résolution des images, l'ouverture numérique de la lentille d'objectif doit être augmentée. L'épi-fluorescence produit un rapport signal / bruit élevé car une certaine quantité de lumière d'éclairage réfléchie se combine avec la lumière émise par l'échantillon. Pour cette raison, le séparateur de faisceau dichroïque est utilisé. Ce séparateur de faisceau agit comme un filtre sélectif de longueur d'onde et ne transmet que la lumière de fluorescence émise à l'oculaire ou à la lentille oculaire.

Quels sont les inconvénients de la microscopie fluorescente?

1. Avec l'illumination des fluorophores au fil du temps à la suite du processus de photoblanchiment, les fluorophores peuvent perdre leur capacité de fluorescence. Le photoblanchiment se produit lorsque les molécules fluorescentes souffrent progressivement des dommages chimiques dus à l'excitation d'électrons pendant la fluorescence. Le photoblanchiment peut gravement affecter la période d'observation d'un échantillon par microscopie à fluorescence. 
2. La microscopie à fluorescence a permis l'examen de cellules vivantes. Cependant, ces cellules vivantes sont sujettes à la phototoxicité (principalement avec la lumière à courte longueur d'onde) et la molécule fluorescente peut produire des agents réactifs spécifiques lorsqu'elle est éclairée, ce qui augmente encore l'effet photo-toxique.
3. La microscopie à fluorescence peut permettre l'imagerie et l'observation de seulement certaines structures qui ont été marquées pour la fluorescence. c'est-à-dire qu'un échantillon de tissu peut être observé à l'aide de microscopies à fluorescence si les échantillons sont présentés avec un colorant ADN fluorescent. Cela pourrait montrer l'organisation de l'ADN dans les cellules mais ne peut rien révéler sur la morphologie cellulaire.

Comment un échantillon fluorescent est-il préparé?

Nous savons que la microscopie à fluorescence permet l'imagerie et l'observation de seulement certaines structures qui ont été marquées pour la fluorescence. Par conséquent, l'échantillon à observer est rendu fluorescent par diverses techniques telles que:

1. Colorants fluorescents biologiques: Plusieurs types de colorants fluorescents sont fabriqués, compatibles avec une gamme d'échantillons biologiques. Quelques exemples de telles taches de fluorescence sont DRAQ7 et DRAQ5 (excités par la lumière rouge), Höchst et DAPI (excité par la lumière ultraviolette de longueur d'onde), phalloïdine, Peptide d'hybridation de collagène, etc.
2. Immunofluorescence: L'immunofluorescence est utilisée pour lier un anticorps.
3. Protéines fluorescentes: Les protéines fluorescentes sont utilisées pour modifier l'ADN de sorte que les molécules présentent une fluorescence.

Pour en savoir plus sur la visite au microscope composé https://techiescience.com/compound-microscope-working-5-important-uses/

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Sanchari Chakraborti

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