Différents types de PCR : des QCM conceptuels importants

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Différents types de PCR

Réaction en chaîne par polymérase (PCR) est largement classée sur la base de légères modifications dans le processus PCR standard. Les différents types de PCR sont les suivants:

PCR imbriquée

Cette technique est proposée pour diminuer les contaminants dans l'ADN amplifié en raison de l'amplification aléatoire de liaison d'amorce. La PCR imbriquée est réalisée avec deux ensembles différents d'amorces dans deux cycles de PCR consécutifs. On s'attend à ce que l'ensemble suivant amplifie la cible secondaire à l'intérieur du produit de l'analyse principale. Cette technique est exceptionnellement réussie, même si elle nécessite beaucoup plus de connaissances sur les séquences impliquées. 

PCR inverse

Elle est effectuée lorsqu'une seule séquence interne d'ADN matrice est connue. Cette technique est appropriée pour l'identification des séquences flanquantes aux différents inserts de gène. Le processus comprend une séquence de digestion et d'auto-ligature de l'ADN matrice, qui se traduit par des morceaux d'ADN avec des séquences connues aux extrémités d'une séquence inconnue.

Différents types de PCR
(Différents types de PCR): Représentation de la structure moléculaire de la Taq polymérase https://commons.wikimedia.org/wiki/File:PDB_1ktq_EBI.jpg

PCR de transcription inverse (RT-PCR)

Il est utilisé pour amplifier et identifier des séquences connues à partir de bibliothèques d'ARN. L'ARN obtenu à partir de l'échantillon est ensuite converti en ADN complémentaire (ADNc) par l'action de l'enzyme transcriptase enzymatique inverse. Une PCR typique a été réalisée par la suite. La RT-PCR est largement utilisée dans l'identification et la détermination de l'expression génique.

Différents types de PCR
(Différents types de PCR): La RT-PCR utilise des fluorophores pour détecter les niveaux d'expression génique https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Molecular_Beacons.jpg

PCR asymétrique

Il amplifie sélectivement un brin de l'ADN matrice plus que l'autre. Il est utilisé dans le sondage d'hybridation dans lequel un seul brin est considéré comme idéal. Une amplification supplémentaire est obtenue en réalisant une PCR standard en présence d'amorces en excès pour le brin choisi. 

PCR quantitative (Q-PCR)

Il s'agit de la procédure indirecte de mesure des quantités initiales d'ARN, d'ADNc ou d'ADN matrice. La Q-PCR est généralement utilisée pour déterminer rapidement la quantité de produit PCR. La Q-PCR est également utilisée pour la détection de séquences spécifiques à l'intérieur de l'échantillon d'ADN.

PCR quantitative en temps réel (QRT-PCR ou RTQ-PCR)

Ce processus utilise des colorants fluorescents pour surveiller et mesurer en temps réel les quantités de produits amplifiés. Cette PCR quantitative en temps réel est utilisée en conjugaison avec QPCR.

PCR Touchdown

Cette technique réduit la liaison d'amorce non spécifique en diminuant la température d'hybridation entre deux cycles consécutifs de PCR.

PCR de colonie

Les clones (Ex. E. coli) sont analysés pour les produits de ligature corrects. Une colonie spécifique est prélevée à l'aide d'un cure-dent stérile et introduite dans le mélange maître. La PCR fonctionne avec un temps prolongé à 95oC.

PCR spécifique à l'allèle

Cette technique est basée sur le polymorphisme nucléotidique unique (SNP), la PCR spécifique à un allèle est souvent utilisée à des fins de clonage et de diagnostic. Des connaissances préalables sur la séquence d'ADN des allèles et leur différence sont nécessaires. La PCR spécifique à un allèle implique l'utilisation d'amorces SNP contenant l'extrémité 3 '. Une amplification par PCR spécifique de l'allèle réussie et des amorces spécifiques du SNP indiquent la présence d'un SNP particulier dans la séquence.

Assemblage de cyclage de polymérase (PCA) ou PCR d'assemblage

Implique la production artificielle des longues séquences d'ADN en présence de longs oligonucléotides et de courts segments chevauchants suivant la procédure standard de PCR. Les oligonucléotides longs basculent dans les deux sens (sens et anti-sens), le segment chevauchante décide de l'ordre des fragments de PCR, facilitant la production sélective du long ADN final.

PCR linéaire après exponentielle (LATE-PCR)

Dans cette technique, l'amorce limitante (amorce présente en quantité inférieure) a un point de fusion plus élevé que l'amorce en excès (amorce présente en quantité suffisante) pour maintenir l'efficacité de la réaction puisque la concentration de l'amorce limitante diminue au milieu de la réaction . 

PCR Dial-Out

C'est une méthode de récupération de molécules d'ADN pour la synthèse génique. Une bibliothèque d'ADN est modifiée avec des balises flanquantes spécifiques avant le séquençage. Plus tard, les amorces dirigées par étiquette permettent la récupération de l'ADN des séquences désirées par PCR.

Amplification dépendante de l'hélicase

Il est lié à la PCR traditionnelle, mais il utilise une température constante au lieu du cycle. L'ADN hélicase est utilisée à la place de l'étape de dénaturation thermique. 

PCR à démarrage à chaud

Cette technique supprime la possibilité d'une amplification non spécifique pendant les cycles initiaux de PCR. Les ingrédients de la réaction sont chauffés à la température de dénaturation qui est de 95oC avant l'ajout de polymérase. Des inhibiteurs et des anticorps sont introduits dans le mélange réactionnel pour inhiber ADN polymérase activité qui se dissocie à haute température. 

PCR spécifique inter-séquence

Cette modification de la technique de PCR est souvent utilisée pour la prise d'empreintes ADN, ce qui nécessite l'amplification de régions placées entre les séquences répétées simples pour générer une empreinte digitale / modèle unique et spécifique de fragments d'ADN amplifiés. 

PCR médiée par ligature

Il utilise spécifiquement de petites molécules de liaison d'ADN (à insérer) et diverses amorces capables de s'hybrider avec l'ADN de liaison. Cette technique est largement utilisée pour le séquençage d'ADN et l'empreinte.

PCR spécifique à la méthylation

Cette technique est utilisée pour la détection des îlots CpG dans le génome. Dans la PCR spécifique de la méthylation, l'ADN est traité avec du bisulfate de sodium, qui convertit la base de cytosine non méthylée en uracile, qui est identifié / reconnu par les bases de thymine d'amorce de PCR. Deux ensembles de PCR différents sont réalisés sur l'ADN modifié en utilisant des ensembles d'amorces identiques à l'exception des îlots CpG des amorces. Les ensembles d'amorces reconnaissent les bases de cytosine et d'autres ensembles d'amorces reconnaissent l'uracile pour amplifier l'ADN non méthylé. La Q-PCR peut également être réalisée pour connaître les informations quantitatives concernant la méthylation. 

QCM conceptuels sur différents types de PCR (résolus)

Question 1: Un chercheur tente de modifier cinq paires de bases successives au milieu d'un fragment d'ADN amplifié par PCR. Quelle technique est la plus recommandée pour réaliser une telle expérience?

A- Ligation d'ADN

B- Test de déplacement de mobilité électrophorétique (EMSA)

C- mutagenèse par PCR

D- Enzyme de restriction digestion

Bonne réponse: Option C mutagenèse par PCR 

Explication:

La technique la plus recommandée pour ce type de modifications est la mutagenèse par PCR. Il peut synthétiser des amorces qui se lient imparfaitement au site souhaité de mutagenèse. Ces amorces contiendront désormais la nouvelle séquence de 5 paires de bases à introduire dans le nouveau brin d'ADN. Premièrement, la PCR amplifiera le fragment d'ADN contenant la séquence mutante et les séquences en amont. Le deuxième cycle de PCR amplifiera le nouveau brin d'ADN contenant la séquence mutante ainsi que les séquences en aval. Et le cycle final de PCR amplifiera un fragment d'ADN à partir des deux modèles, en utilisant les amorces d'origine pour amplifier le brin d'ADN de pleine longueur.

Question 2: La réaction en chaîne par polymérase (PCR) utilise une polymérase thermostable (Taq polymérase) pour amplifier le brin d'ADN. Lequel des énoncés décrit le mieux pourquoi les polymérases thermostables sont nécessaires pour la PCR?

La PCR a besoin d'un cyclage thermique et les polymérases Taq peuvent être inactivées puisqu'elles ne sont pas nécessaires pendant les étapes à basse température. 

B- La polymérase thermostable (Taq) ne rompt pas l'ADNdb sauf si la température est très élevée. Par conséquent, une polymérase thermostable (Taq) est nécessaire.

La C-PCR nécessite un cycle thermique et les polymérases thermostables (Taq) ne se dénatureront pas pour perdre leur efficacité dans la polymérisation de l'ADN à haute température (95oC) étape. 

D- L'interaction entre les cations divalents et l'ADN polymérase est très efficace lors des étapes à haute température. Ainsi, la PCR nécessite une ADN polymérase thermostable.

E- Les polymérases thermostables (Taq) sont moins chères que les polymérases standard; ainsi, ils sont plus appropriés pour amplifier l'ADN. 

Bonne réponse: Option C

La PCR nécessite un cyclage thermique, et les polymérases thermostables (Taq) ne se dénatureront pas pour perdre leur efficacité dans la polymérisation de l'ADN à haute température (95oC) étape. Cela le rend unique parmi les différents types de PCR.

Explication:

Les polymérases se dénaturent souvent à des températures plus élevées. Si une polymérase standard était utilisée, elle se dénaturerait pendant l'étape à haute température (dénaturation), qui est nécessaire pour casser l'ADN double brin en matrices d'ADN simple brin. En utilisant cette polymérase thermostable (Taq), le l'enzyme ne dénaturera pas. Les brins d'ADN continueront à s'amplifier par la polymérase Taq ajoutée au début de la PCR.

Question 3: Quel est l'ordre correct des trois étapes de la PCR?

A- Extension, dénaturation, recuit

B- Dénaturation, recuit, extension 

C- Recuit, extension, dénaturation

D- Dénaturation, extension, recuit

Bonne réponse: Option B

Dénaturation, recuit, extension 

Explication:

Les étapes de la PCR impliquent la dénaturation, l'hybridation et l'extension.

La dénaturation est effectuée à une température d'environ 94 à 98 ° C pour rompre les liaisons hydrogène de l'ADN double brin. 

Le recuit est la deuxième étape de la PCR réalisée à 50-65 ° C. L'étape d'hybridation doit être réalisée à basse température pour la fixation des amorces au simple brin, mais suffisamment élevée pour éviter une hybridation non spécifique. 

L'étape d'extension ou d'élongation de la PCR permet à l'ADN polymérase de synthétiser la dernière copie du brin d'ADN matrice. La température optimale dépend de l'ADN polymérase utilisée mais se situe généralement entre 75 et 80 ° C.

Question 4: Lequel des éléments suivants est / n'est pas un composant d'un mélange de réaction en chaîne par polymérase?

A- Solution tampon

B- ADN polymérase

C-Formamide

D- Brin matrice d'ADN

Bonne réponse: Option C

Formamide

Explication:

Les ingrédients de la PCR sont l'ADN (Taq) polymérase, le tampon, les amorces, le chlorure de magnésium, les dNTP (adénine, guanine, cytosine, thymine), les désoxynucléotides triphosphates et le brin matrice d'ADN.

Conclusions

Dans cet article, nous avons discuté de différents types de PCR. Pour plus d'informations sur ce sujet, visitez différents types de PCR.

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